免疫检测原理及在其基础上发展起来的现代检测技术?
关注问题免疫检测的原理是基于抗原和相应的抗体可以在体外发生特异性结合,由于抗原的物理性状和参加反应的辅助物质的不同,抗原抗体结合后可出现凝集、沉淀、补体结合等现象。对这些现象进行观察和分析可检测抗原或抗体。用已知的抗原检测抗体,也可用已知的抗体检测抗原。由于实验室要用血清作为试验材料,所以这类抗原-抗体的实验方法常称为血清学方法或血清学试验。
以下是几种常用的免疫学技术:
(1)免疫荧光技术 免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体(或抗原)检测组织、 细胞或血清中的相应抗原(或抗体)的方法。由于荧光抗体具有安全、 灵敏的特点,因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途,如在细菌、病毒、 螺旋体感染的疾病,检查IgM抗体,作为近期接触抗原的标志。利用单克隆荧光直接标记抗体鉴定淋巴细胞的 亚类。通过流式细胞仪,针对细胞表面不同抗原,可以同时使用多种不同的荧光抗体,对同一细胞进行多标记染色。
(2)放射免疫检测 放射免疫检测技术是目前灵敏度最高的检测技术,利用放射性同素标记抗原(或抗体),与相应抗体(或抗原)结合后,通过测定抗原抗体结合物的放射性检测结果。放射性同位素具有pg级的灵敏度,且利用反复曝光的方法可对痕量物质进行定量检测。但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用。
(3)酶联免疫吸附试验(ELISA), 酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法.该方法是将二抗标记上酶(标记抗体),抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来,根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果,其敏感度可达ng水平。常用的方法有间接法、夹心法。间接法是先将待测的蛋白包被在孔板内,然后依次加入一抗(捕获抗体)、标记了酶的二抗(标记抗体)和底物显色,通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原,这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差。目前已逐渐被夹心法取代,夹心法利用二种一抗对目标抗原进行捕获和固定,在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。
(4)全自动免疫化学分析系统是目前最先进的标记免疫测定技术,灵敏度和精确度又比荧光法、酶免法高几个数量级,可以完全替代有放射性的放射免疫分析。免疫化学分析系统中包含两个部分,化学发光反应系统和免疫反应系统,即在抗原一抗体特异性反应过程中,伴随有化学反应过程而产生光的发射现象。化学反应系统中以化学反应为基础,化学发光的首要条件是吸收了化学能而处于激发态的分子或原子必须能释放出光子或者能将能量转移到另一个物质的分子上并使这种分子激发,当这种分子回到基态时释放出光子。发光检测仪可测量光量子的产额,定量分析待测物的含量。免疫化学分析采用的抗原一抗体反应的载体不再是酶联免疫吸附的孔板而是微球(淋巴细胞大小)。微球检测的优势一是使可发生反应的表面积增加,结合的捕获抗原或抗体更多,使检测的线性范围有数量级的增大。优势二是微球的体积很小,在液态的反应体系中做动态的运动,提高抗原-抗体结合的概率,提高检测的灵敏度和重复性。目前国内主要有三类最先进的全自动免疫化学分析系统(化学发光免疫分析系统;荧光免疫分析系统和电化学发光免疫分析系统)广泛的应用于临床,对血清肿瘤标记物检测具有快速、准确、半定量。可检测AFP、CEA、CA199、CA724、CA125、CA153、NSE、Cyfra21-1、PSA、f- PSA等。